JIS Z 2801 抗菌加工製品－抗菌性試験方法・抗菌効果｜日本産業規格｜最新情報 更新 改正制定

この規格は，繊維製品と光触媒抗菌加工製品を除く，プラスチック製品，金属製品，セラミックス製品など抗菌加工を施した製品（中間製品を含む。）の表面における細菌に対する抗菌性試験方法と抗菌効果について規定する。

なお，防かび，防臭，生物劣化などの抗菌効果の副次的効果は，この規格に含めない。

注記1 製品の使用用途，形状などから，繊維製品の試験方法が妥当と判断される製品にあっては，JIS L 1902に規定する箇条10（定量試験）を用いてもよい。

注記2 この規格の対応国際規格とその対応の程度を表す記号を，次に示す。

ISO 22196:2007，Plastics－Measurement of antibacterial activity on plastics surfaces（MOD）

ISO 22196:2011，Measurement of antibacterial activity on plastics and other non-porous surfaces

なお，対応の程度を表す記号「MOD」は，ISO/IEC Guide 21-1に基づき，「修正している」ことを示す。

次に掲げる規格は，この規格に引用されることによって，この規格の規定の一部を構成する。これらの引用規格は，その最新版（追補を含む。）を適用する。

JIS K 0050化学分析方法通則

JIS K 0950 プラスチック製滅菌シャーレ

JIS K 0970 プッシュボタン式液体用微量体積計

JIS K 3800バイオハザード対策用クラスIIキャビネット

JIS K 8101 エタノール（99.5）（試薬）

JIS K 8150 塩化ナトリウム（試薬）

JIS K 8180 塩酸（試薬）

JIS K 8263 寒天（試薬）

JIS K 8576 水酸化ナトリウム（試薬）

JIS K 9007 りん酸二水素カリウム（試薬）

JIS K 9017 りん酸水素二カリウム（試薬）

JIS R 3505 ガラス製体積計

JIS Z 8802 pH測定方法

この規格で用いる主な用語と定義は，次による。

製品の表面における細菌の増殖を抑制する状態。

直接又はコンパウンドとして用いることによって製品の表面における細菌の増殖を抑制する薬剤。

抗菌を目的とする加工。

抗菌加工を施した製品。

抗菌加工製品と無加工製品とにおける細菌を接種培養後の生菌数の対数値の差を示す値。

抗菌活性値から判断される抗菌加工製品の効果。

この規格の試験方法によって得られる抗菌活性値が2.0以上のとき，抗菌加工製品は抗菌効果があるものと判断する。

なお，受渡当事者間の合意により，2.0よりも大きい抗菌活性値をもって抗菌効果の有無を判断してもよい。

試験に用いる細菌の種類は，次によるものとし，それぞれの細菌について試験を行う。

• a) 黄色ぶどう球菌（Staphylococcus aureus）（スタフィロコッカス・アウレウス）
• b) 大腸菌（Escherichia coli） （エシェリヒア・コリー）

試験に用いる細菌の菌株の一例を，表1に示す。表1に示す保存機関以外から分譲された菌株を使用す

る場合は，分譲機関が世界微生物株保存連盟（WFCC：World Federation for Culture Collections）又は日本微生物株保存連盟（JSCC：Japan Society for Culture Collections）に加盟している機関であり，かつ，表1と同一系統の菌株とする。

この規格で用いる薬品，材料，器具と装置は，特に指定がない限り，次による。

• エタノール（C₂H₅OH） JIS K 8101に規定する特級以上のもの。
• 肉エキス ：微生物試験用のもの。
• ペプトン ：微生物試験用のもの。
• 塩化ナトリウム（N_aCl） JIS K 8150に規定する特級のもの。
• 精製水 第15改正日本薬局方の基準に適合するもの。
• 寒天 JIS K 8263に規定する特級以上のもの。
• 酵母エキス ：微生物試験用のもの。
• トリプトン ：微生物試験用のもの。
• グルコース ：微生物試験用のもの。
• カゼイン製ペプトン ：微生物試験用のもの。
• 大豆製ペプトン ：微生物試験用のもの。
• レシチン ：微生物試験用のもの。
• 非イオン界面活性剤 ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート。 ［ポリソルベート80（Tween80）］
• りん酸二水素カリウム（KH₂PO₄）：JIS K 9007に規定する特級のもの。
• りん酸水素二カリウム（K₂HPO₄） ： JIS K 9017に規定する特級のもの。
• 水酸化ナトリウム（N_aOH） ： JIS K 8576に規定する特級のもの。
• 塩酸（HCl）： JIS K 8180に規定する特級のもの。
• 綿栓： 青梅綿を使用したもの，又はシリコン栓，金属栓，モルトン栓など。
• 白金耳： 先端のループが約4 mmのもの。
• 乾熱殺菌器： 温度を160～180 °Cに保てるもの。
• オートクレーブ： 温度121 °C（圧力103 kPa相当）に保てるもの。
• 安全キャビネット： JIS K 3800又は同等の性能をもつもの。
• pH計： JIS Z 8802に規定するpH計 化学はかり JIS K 0050に規定する化学はかり又は同等の性能をもつもの。
• クリーンベンチ： 微生物試験用のもの。
• メスピペット： JIS K 0970若しくはJIS R 3505のクラスAに適合又は同等の精度をもつもの。
• 培養器： 温度±1 °Cに保てるもの。
• シャーレ： 内径約90 mmのガラス製，又はJIS K 0950に規定する90A号若しくは90B号に適合するもの。
• ストマッカー袋： 微生物試験用のもの。
• ストマッカー： 微生物試験用のもの。
• フィルム： ポリエチレンフィルムなど微生物の発育に影響を及ぼさず，吸水性がなく密着性のよい材質を使用する。厚さは特に規定しない。

試験管，メスピペットなどのガラス製器具は，アルカリ又は中性洗剤で十分に洗浄し，水で十分すすいで乾燥してから乾熱殺菌するか，高圧蒸気殺菌したものを用いる。その殺菌方法は，次のa) 又はb) による。また，白金耳と試験菅を火炎殺菌する場合は，次のc) による。

• a) 乾熱殺菌 殺菌対象物を，乾熱殺菌器中で170 °Cの場合60分以上，160 °Cの場合120分以上の時間で殺菌する。ただし，乾熱殺菌終了後，殺菌対象物の綿栓，包装紙などが水でぬれたときは，その器具は用いてはならない。
• b) 高圧蒸気殺菌 オートクレーブに水を入れ，金網の棚に殺菌対象物を金網かごに入れて載せる。オートクレーブのふたを締めて加熱し，温度121 °C（圧力103 kPa相当）に15～20分間保つ。加熱を止め，100 °C以下に自然冷却後，排気弁を開き蒸気を抜き去り，ふたを開け殺菌したものを取り出し，必要に応じてクリーンベンチ又は安全キャビネット内で冷却する。オートクレーブは，培地，加工薬剤による汚染を防ぎ，清浄に保つため，必要に応じ中性洗剤で洗浄し水で十分にすすぐ。
• c) 火炎殺菌 殺菌対象物と部位をガス又はアルコールの火炎に当てる。白金耳の場合は十分に赤熱し，試験管の場合は，2～3秒間火炎に当てる。

培地などは，次に示す組成のものを用いる。また，同一の組成のものであれば，市販品を用いることができる。

• a) 普通ブイヨン培地［1/500普通ブイヨン培地（1/500 NB）］ 精製水又はイオン交換水1,000 mLに対して化学はかりで計量した肉エキス3.0 g，ペプトン10.0 gと塩化ナトリウム5.0 gを加え混合後，溶解し普通ブイヨン培地を調製する。精製水で普通ブイヨン培地を500倍の量に希釈し，pH計を用いpH 7.0～7.2（25 °C）になるように水酸化ナトリウム溶液又は塩酸溶液で調整し，高圧蒸気殺菌する。調製後，直ちに使用しないものは5～10 °Cの温度で保存する。調製後1週間以上過ぎた1/500 NBは用いてはならない。
• b) 普通寒天培地 精製水又はイオン交換水1,000 mLに対して肉エキス5.0 g，ペプトン10.0 g，塩化ナトリウム5.0 gを加え混合後，pH 7.0～7.2（25 °C）になるように水酸化ナトリウム溶液又は塩酸溶液で調整し，これに寒天粉末15.0 gを加え，加熱溶解した後，綿栓をして高圧蒸気殺菌する。調製後，直ちに使用しないものは5～10 °Cの温度で保存する。調製後1か月以上過ぎた普通寒天培地は用いてはならない。
• c) 標準寒天培地 精製水又はイオン交換水1,000 mLに対して化学はかりで計量した酵母エキス2.5 g，トリプトン5.0 g，グルコース1.0 gと寒天粉末15.0 gを加え混合後，加熱溶解した後，pH計を用いpH 7.0～7.2（25 °C）になるように水酸化ナトリウム溶液又は塩酸溶液で調整し，これに寒天粉末15.0

gを加え高圧蒸気殺菌する。調製後，直ちに使用しないものは5～10 °Cの温度で保存する。調製後1か月以上過ぎた標準寒天培地は用いてはならない。

• d) 斜面培地 試験管にあらかじめ温めて溶解したb) の普通寒天培地を6～10 mL注ぎ，綿栓をして高圧蒸気殺菌する。殺菌終了後，清浄な室内に試験管を水平面に対して約15度傾けて置き，内容物を凝固させる。調製後，直ちに使用しないものは5～10 °Cの温度で保存する。凝結水がなくなったものは溶解し，再び凝固させて使用する。調製後1か月以上過ぎた斜面培地は用いてはならない。
• e) SCDLP培地 精製水又はイオン交換水1,000 mLに対して化学はかりで計量したカゼイン製ペプトン17.0 g，大豆製ペプトン3.0 g，塩化ナトリウム5.0 g，りん酸水素二カリウム2.5 g，グルコース2.5 gとレシチン1.0 gを加え，混合溶解した後，非イオン界面活性剤7.0 gを加えて溶解させる。pH計を用いpH 6.8～7.2（25 °C）になるように水酸化ナトリウム溶液又は塩酸溶液で調整し，高圧蒸気殺菌する。調製後，直ちに使用しないものは5～10 °Cの温度で保存する。調製後1か月以上過ぎたSCDLP培地は用いてはならない。
• f) りん酸緩衝液 化学はかりで計量したりん酸二水素カリウム34.0 gに，精製水又はイオン交換水500

mLを加えて混合溶解した後，pH計を用いpH 6.8～7.2（25 °C）になるように水酸化ナトリウム溶液で調整する。さらに，精製水又はイオン交換水を加えて1,000 mLとし，高圧蒸気殺菌する。調製後1か月以上過ぎたりん酸緩衝液は用いてはならない。

• g) りん酸緩衝生理食塩水 f) のりん酸緩衝液を生理食塩水（0.85 %塩化ナトリウム溶液）で800倍に希釈する。必要に応じて試験管又は三角フラスコに分注し，綿栓をして高圧蒸気殺菌する。調製後，直ちに使用しないものは5～10 °Cの温度で保存する。調製後1か月以上過ぎたりん酸緩衝生理食塩水は用いてはならない。

細菌の移植は，無菌的に行う。必要に応じて安全キャビネットを使用する。片手に元株と移植しようとする5.4 d) の斜面培地（普通寒天培地）を，もう一方の手に白金耳の柄を持ってその手で綿栓を抜き取り，試験管の口を火炎殺菌する。白金耳を火炎殺菌し，新しい斜面培地の凝結水のある部分に白金耳の先をつけて冷却し，これを用いて元株の菌体を一部かき取り，新しい斜面培地に画線塗抹する。

その方法は，図1のように，白金耳の先を凝結水につけて細菌を分散し，ここから斜面上方まで白金耳で直線を引くか，又は白金耳の先を再び凝結水につけて蛇行させながら斜面上方まで線を引く。

再び試験管の口を火炎殺菌し，元のように綿栓する。使用した白金耳は火炎殺菌しておく。移植を行った斜面培地を培養器中で温度35±1 °Cで24～48時間培養し，その後は，温度5～10 °Cで保存する。移植してから1か月以内に次の移植を同様に行い継代培養する。継代回数は，菌株保存機関から分譲された元株から数えて5回を限度とする。また，移植して1か月以上過ぎたものは，次の移植に用いてはならない。

なお，菌株保存機関から分譲された菌株を，凍結乾燥，凍結などの長期間保存可能な方法で保存した場合は，保存菌株を作成するために元株から培養した継代回数を保存菌株の継代回数とする。この保存菌株を試験に用いる場合は，5回から保存菌株の継代回数を引いた回数を使用限度とする。

図1－細菌の移植

細菌の取扱いは，無菌的に行うとともに試験実施者，器具と作業環境の細菌汚染に注意する。必要に応じて安全キャビネットを使用し，次による。

• a) 試験菌の前培養 5.5の保存菌株から5.4 d) の斜面培地に1白金耳量移植し，培養器中で温度35±1 °Cで16～24時間培養する。さらに，この培養菌から新たな斜面培地に1白金耳量移植し，培養器中で温度35±1 °Cで16～20時間培養する。
• b) 試験片の調製 試験片の調製は，次による。
• 1) 製品の平らな部分を50±2 mm角（厚さ10 mm以内）の正方形に切り取り，これを標準の大きさの試験片とする。ただし，この正方形に切り取ることが困難又は不可能な場合，表面積400～1,600mm² のフィルムをかぶせることが可能な試験片の形状と大きさであれば，この形状と大きさ以外の試験片を使用してもよい。
• 2) 無加工試験片は，抗菌無加工製品又はフィルムから切り取ったものとし，無加工試験片6個のうち，3個は試験菌液接種直後の生菌数測定用に，残りの3個は24時間培養後の生菌数測定に用いる。
• 3) 無加工試験片が準備できない場合は，5.2のフィルムを使用してもよい。試験片の調製に当たっては微生物汚染，製品間の相互汚染と汚れに十分注意する。試験片は，製品そのものから採取することが望ましいが，製品の形状から試験片の調製が困難な場合は，同じ原材料と加工方法で別途平板状に加工したものから試験片を調製してもよい。
• 4) 無加工試験片を所定枚数準備できない場合で，半数（3個）準備できる場合には，24時間培養後の生菌数測定用として無加工試験片3個を使用し，試験菌液接種直後の生菌数測定用にはフィルムを代用する。半数（3個）準備できない場合は，すべてフィルムを使用する。
• c) 試験片の清浄化 b) の試験片の全面を，エタノールを吸収させた局方ガーゼ又は脱脂綿で軽く2～3回ふいた後，十分に乾燥する。

これらの処理をすることによって，試験片の軟化，表面の塗装の溶解，成分の溶出などの変化が起こり，これらが原因で試験結果に影響を及ぼすと判断される場合においては，他の適切な方法を用いて清浄化するか，又は清浄化せずにそのまま試験に用いる。

• d) 試験菌液の調製 a) で前培養した試験菌の菌体1白金耳量を，少量の5.4 a) の1/500 NBに均一に分散させ，顕微鏡による直接観察又はその他の適切な方法によって菌数を推定する。この菌液を1/500

NBを用いて適宜希釈し，菌数が2.5×105～10×105個/mLとなるように調整し，これを試験菌液とする。試験菌液をすぐに使用しない場合は氷冷（0 °C）保存し，保存後2時間以内に使用する。

• e) 試験菌液の接種 試験菌液の接種は，次による。
• 1) c) の各試験片の試験面を上にして滅菌済シャーレ内に置く。ただし，試験面は抗菌加工が施されている製品の表面とする。内部まで抗菌加工されている製品であっても，切断面は試験面としない。
• 2) d) の試験菌液をメスピペットで正確に0.4 mL採取し，これをシャーレ内の各試験片に滴下する。標準の大きさ以外の試験片の接種菌液量は，被覆したフィルムの面積比で案分する。また，標準の大きさの試験片であっても，規定に基づく菌液量を接種したとき，陶磁器，タイル，ほうろう，ガラスなどのぬれ性が極めて良い試験片では，わずかな傾斜でフィルムが移動したり，フィルムの端から菌液が漏れ出す場合がある。このような場合は，接種菌液の液量を規定量の1/4を限度に減じてもよい。ただし，試験片に接種する菌数は，接種菌液量を少なくした場合においても，6.2×103～2.5×104個/cm2とする。
• 3) 滴下した試験菌液の上にフィルムをかぶせ，菌液がフィルムの端からこぼれないように注意しながら，試験菌液がフィルム全体に行きわたるように軽く押さえつけた後，シャーレのふたをする【図2参照】。フィルムの大きさは，40±2 mm角の正方形を標準とする。試験片が標準の大きさ以外の場合は，フィルムの四方の端が試験片より2.5 mm～5.00 mm以内となるように大きさを調整する。ただし，フィルムの大きさは400mm² より小さくしてはならない。また，試験片の形状が平面でなくてフィルムを密着させることが困難な場合，親水性があってフィルムを被覆しなくても菌液が試験片全体に拡散する場合などにおいては，フィルムをかぶせる操作を省略することができる。フィルムをかぶせる操作を省略した場合は，5.6 b) 1)において調製する試験片の大きさは40±2 mm角（厚さ10 mm以内】を標準の大きさとする。

なお，試験菌液の接種に当たって，親水性が高い表面をもつ試料など，どうしても試験菌液がフィルムの端から漏れてしまう場合は，菌液量を0.1 mLを限度として減量して接種する。この場合には，通常量の接種菌液を適用する場合又は同数の細菌個数を提供するために菌液中の細菌数の濃度を高める。

図2－試験片への菌液の滴下とフィルムの被覆

• f) 試験菌液を接種した試験片の培養 試験菌液を接種した試験片（無加工試験片3個と抗菌加工試験片3個）の入ったシャーレを培養器中で温度35±1 °C，相対湿度90 %以上で24±1時間培養する。

注記 製品の抗菌効果は，ここで規定する培養温度で試験して得られた抗菌活性値から判断されるが，すべての当事者が合意する場合は，抗菌加工製品が実際に使用される温度を考慮した温度（室温など）も合わせて試験してもよい。

• g) 接種した試験菌の洗い出し 接種した試験菌の洗い出しは，次による。
• 1) 試験菌液接種直後の試験片 試験菌液を接種した直後の無加工試験片3個について，被覆フィルムと試験片をそれぞれ菌液がこぼれないように注意しながらそれぞれ別のシャーレに置く。シャーレ内に5.4 e) のSCDLP培地10 mLを加え，メスピペットで無加工試験片上の試験菌を最低4回洗い出し菌液を完全に回収する。この洗い出し液は，速やかに生菌数測定に供する。
• 2) 培養後の試験片 f) の培養後の試験片について，1) と同様に試験菌を洗い出す。この洗い出し液は，速やかに生菌数測定に供する。
• 3) 試験菌の洗い出しについては，被覆フィルムと試験片をそれぞれ菌液がこぼれないように注意しながら滅菌したピンセットを用いて滅菌済ストマッカー袋内に入れ，これにメスピペットで5.4 e)のSCDLP培地10 mLを加え，手又は微生物試験用の抽出装置（ストマッカーなど）で試験片と被覆フィルムを十分にもみ，試験菌を洗い出す方法も適用できる。また，これらの方法と同等又はそれ以上の回収率が認められる方法であれば他の方法を用いてもよい。試験片の大きさと特性上SCDLP培地10 mLで洗い出しが困難な場合は，液量を増やしてもよい。